Bệnh hậu ấu trùng mờ đục (translucent post-larvae disease - TPD) hay còn gọi là bệnh hậu ấu trùng thủy tinh (glass post larvae disease - GPD), đây là một bệnh tôm mới nổi nghiêm trọng. Bệnh này đã gây ảnh hưởng nặng nề đến tôm nuôi và dẫn đến thiệt hại nghiêm trọng đến kinh tế ngành thủy sản ở Trung Quốc đặc biệt vào mùa xuân năm 2020. Gần đây nhóm nghiên cứu người Trung Quốc đã có những phát hiện mới về tác nhân gây bệnh này trên tôm giống, cụ thể là bệnh này nhiễm trên tôm thẻ chân trắng ở giai đoạn PL4 - PL7 và bước đầu xác định tác nhân gây bệnh là do Vibrio parahaemolyticus, vi khuẩn này có protein độc lực VHVP-2 là độc tố chính. Protein này được mã hóa bởi gen vhvp-2 nằm trên plasmid 187.892 bp của bộ gen vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus làm tôm chết có dấu hiệu mờ đục (VpTPD). Việc xác định đúng tác nhân gây bệnh sẽ hỗ trợ cho các nghiên cứu sâu hơn về cơ chế gây bệnh của VpTPD và phát triển các kỹ thuật chẩn đoán phát hiện sớm bệnh TPD ở trại tôm giống. Trong khuôn khổ bài viết này sẽ khái quát lại đặc điểm xuất hiện bệnh, dấu hiệu bệnh lý, loài cảm nhiễm, tác nhân gây bệnh và biện pháp phòng trị. 

       1. Đặc điểm xuất hiện bệnh

       Từ cuối năm 2019 đến đầu năm 2020, một loại bệnh mới trên tôm có tên là bệnh hậu ấu trùng mờ đục (TPD) hay bệnh hậu ấu trùng thủy tinh xuất hiện ở các tỉnh ven biển phía Nam Trung Quốc (tỉnh Quảng Đông và Quảng Tây). TPD ngày càng trở nên phổ biến, gây thiệt hại 70%-80% trại ương tôm ven biển ở Trung Quốc vào mùa xuân năm 2020. Đặc biệt, kể từ tháng 3/2020, bệnh TPD đã xảy ra ở một số trại sản xuất giống tôm thẻ chân trắng, sau đó căn bệnh mới này bắt đầu lan sang các vùng nuôi tôm lớn ở phía Bắc Trung Quốc thông qua hậu ấu trùng (PL).

       Một cuộc khảo sát cho thấy tỷ lệ nhiễm TPD trên tôm là rất cao và tỷ lệ nhiễm TPD ở các vùng nuôi tôm khác nhau cho tỷ lệ nhiễm khác nhau. Cụ thể, tôm được thu thập từ các trang trại nuôi tôm ở các tỉnh Hà Bắc, Sơn Đông, Giang Tô, Hải Nam, Tân Cương, Hồ Nam, Hồ Bắc và Quảng Đông của Trung Quốc từ 4/2020 đến năm 2021 đều xác định nhiễm bệnh TPD. 
 

Hình 1. Vùng xuất hiện bệnh TPD trên tôm nuôi ở Trung Quốc

       2. Dấu hiệu bệnh lý

       Hậu ấu trùng tôm nhiễm bệnh có các triệu chứng lâm sàng điển hình như gan tụy nhợt nhạt hoặc không màu, đường tiêu hóa trống rỗng, khiến cá thể nhiễm bệnh trở nên trong suốt, trong mờ; do đó, những cá thể bị bệnh này được nông dân địa phương đặt tên là “hậu ấu trùng mờ đục” hoặc “hậu ấu trùng thủy tinh”. Một tỷ lệ lớn hậu ấu trùng bị ảnh hưởng chìm xuống đáy bể nuôi, khả năng bơi lội giảm do bệnh gây ra.

Hình 2. Ấu trùng tôm thẻ chân trắng bị mờ đục, gan tụy nhợt nhạt, đường tiêu hóa trống rỗng

       Nhiễm TPD ở hậu ấu trùng trên tôm có thể gây ra những thay đổi mô bệnh học rõ ràng tương tự ở một mức độ nào đó với bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (AHPND). Các tế bào biểu mô của ống gan tụy và ruột giữa bị hoại tử và bong tróc. Một số lượng lớn vi khuẩn xâm chiếm có thể được quan sát thấy ở gan tụy và ruột giữa dưới kính hiển vi. 

Hình 3. Mô gan tụy tôm bệnh bị tổn thương, làm thay đổi cấu trúc và có xuất hiện vi khuẩn

       3. Loài và giai đoạn nhiễm bệnh

       Bệnh TDP chủ yếu ảnh hưởng hậu ấu trùng 6-12 ngày tuổi (PL6 ~ 12), có báo cáo trên hậu ấu trùng giai đoạn PL4-PL7 của tôm thẻ chân trắng Penaeus vannamei. Tỷ lệ chết cao có thể lên tới 90 %-100 % trong vòng 72 giờ kể từ sự xuất hiện của một cá thể bất thường. Từ tháng 4 đến tháng 5 năm 2020, TPD lây lan nhanh chóng ở các vùng nuôi tôm thẻ chân trắng chính ở Trung Quốc. Kết quả là 80% trại sản xuất giống ở các vùng nuôi tôm ven biển chính của Trung Quốc đã ngừng sản xuất hậu ấu trùng tôm thẻ chân trắng vào năm 2020 và sự lây lan của TPD đã đặt ra mối đe dọa mới cho sự phát triển của ngành tôm.

       Gần đây, một đánh giá cho thấy các mẫu dương tính với VpTPD được phát hiện ở hầu hết các ao nuôi tôm ở các tỉnh nuôi tôm khác nhau của Trung Quốc, với tỷ lệ lưu hành vượt quá 50% ở một số khu vực. Các loài nuôi trong nước biển như P. vannamei và P. japonicus nhạy cảm hơn với VpTPD và có nhiều khả năng bị nhiễm hoặc mang mầm bệnh này hơn. Tôm nuôi nước ngọt như Macrobrachium rosenbergii và Procambarus clarkii có thể không bị ảnh hưởng bởi VpTPD. Tuy nhiên, tôm vẫn có nguy cơ mang hoặc nhiễm bệnh VpTPD. VpTPD vẫn còn phổ biến và lan rộng ở các vùng nuôi tôm ven biển ở Trung Quốc với nguy cơ lây truyền cao. 

       4. Tác nhân gây bệnh

       Các tôm bệnh có dấu hiệu điển hình mờ đục sẽ được lấy mẫu để phân lập vi khuẩn và các chủng vi khuẩn này sau khi phân tích trình tự gen 16S rRNA. Kết quả chủng JS20200428004-2 thuộc giống Vibrio có độ tương đồng cao nhất với V. parahaemolyticus (99,93%). Sau đó, việc xác định sâu hơn về phân loại vi khuẩn được thực hiện bằng phân tích trình tự MLSA. Trình tự MLSA phân tích gen rpoD - rctB - toxR cũng xác định rõ ràng chủng JS20200428004-2 là chủng gần nhất với vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus. Khuẩn lạc vi khuẩn JS20200428004-2 cho thấy màu trắng sữa trên môi trường thạch TSA với cạnh gọn gàng và bề mặt nổi, đường kính là 1,79 mm sau khi ủ trong 24 giờ ở 28°C; tuy nhiên, khuẩn lạc có màu vàng nhạt trên môi trường thạch TCBS và đường kính là 2,04 mm sau khi ủ trong 24 giờ ở 28°C.  Kết quả định danh vi khuẩn cho thấy hậu ấu trùng tôm thẻ chân trắng có thể là vật mang mầm bệnh hoặc bị nhiễm Vp -JS20200428004-2. Bên cạnh đó, kết quả xét nghiệm sinh hóa cho thấy các thông số của Vp -JS20200428004-2 giống hệt với vi khuẩn Vibrio.

Hình 4. Khuẩn lạc vi khuẩn và tỷ lệ chết tích lũy của tôm khi cảm nhiễm với vi khuẩn V. parahaemolyticus phân lập từ tôm bệnh

       Mặc dù xác định tác nhân do V. parahaemolyticus tuy nhiên vẫn chưa biết chính xác tôm chết do gen độc lực nào. Do đó, các thử nghiệm cảm nhiễm ngâm tôm với một loại protein có kích thước nhỏ (MW >100 kDa) từ dung dịch ly giải của VpTPD, kết quả tác nhân này có thể gây ra mức sát thương tương tự cho hậu ấu trùng tôm là giống thuần chủng của VpTPD. Kết quả này bước đầu chỉ ra rằng yếu tố độc lực của VpTPD phải nằm ở phần protein có MW >100 kDa. Ngoài ra, phần nổi phía trên của môi trường nuôi cấy VpTPD không cho thấy bất kỳ độc lực đáng kể nào ảnh hưởng đến hậu ấu trùng.

Hình 5. Kết quả thử nghiệm sự nhiễm bệnh của các protein độc lực có kích thước khác nhau

       Tuy nhiên, cơ chế gây bệnh của VpTPD vẫn chưa được hiểu đầy đủ, điều này hạn chế việc phòng ngừa và kiểm soát hiệu quả bệnh VpTPD trong thực hành nuôi tôm thực tế. Thực hiện các nghiên cứu chuyên sâu, bao gồm các thử nghiệm thử cảm nhiễm, phân tích khối phổ, phân tích mô bệnh học và phân tích gen so sánh để xác định cụ thể yếu tố độc lực. Kết quả cho thấy rằng protein độc tố mới, được chỉ định là VHVP-2 (MW >100 kDa) được mã hóa bởi gen vhvp-2, protein này chứa các miền được bảo tồn của protein plasmid độc lực Salmonella.
 

 Hình 6. Kết quả đánh giá protein độc lực VHVP-2 được mã hóa bởi gen vhvp-2 ở vi khuẩn V. parahaemolyticus 

       Các nghiên cứu dịch tễ học chỉ ra rằng gen vhvp-2 chỉ xuất hiện ở tôm bị bệnh với hội chứng TPD điển hình. Hơn nữa, các thí nghiệm xóa và bổ sung các đột biến của gen vhvp-2 ở VpTPD xác nhận thêm rằng gen vhvp-2 đóng vai trò quan trọng trong việc hiện thực hóa VpTPD độc lực. Trong khi đó, kết quả điều tra dịch tễ học và cảm nhiễm chỉ ra rằng chủng V. parahaemolyticus chỉ mang gen vhvp-1 và thiếu gen vhvp-2 không thể gây chết ấu trùng P. vannamei thí nghiệm. Tất cả kết quả nêu trên chỉ ra rằng vhvp-2 là gen độc lực chính của VpTPD ở P. vannamei. Cơ chế chức năng của yếu tố độc lực VHVP-2 trong việc gây ra sự bong tróc các tế bào biểu mô ruột của tôm nhiễm VpTPD cần được tiếp tục điều tra nghiên cứu.

       Tóm lại, VHVP-2 là độc tố chính của VpTPD và được mã hóa bởi gen vhvp-2 nằm trên gen 187.892-bp plasmid của bộ gen VpTPD. Điều này có nghĩa là mầm bệnh cơ hội V. parahaemolyticus trở nên độc hại gây chết đối với hậu ấu trùng tôm bằng cách có được yếu tố độc lực VHVP-2. Ngoài ra, nghiên cứu này đã thiết lập phương pháp phát hiện PCR VpTPD cho cảnh báo sớm TPD. Những kết quả này đã chứng minh những hiểu biết mới về cơ chế gây bệnh của VpTPD và cung cấp phương pháp phát hiện phân tử đầu tiên cho VpTPD. Chúng sẽ hữu ích cho việc điều tra sâu hơn về VpTPD về mặt kỹ thuật chẩn đoán và cơ chế gây bệnh cũng như phòng ngừa và kiểm soát TPD. 
5. Biện pháp phòng trị.

       Hiện nay, cơ chế lây nhiễm và gây bệnh của tác nhân gây bệnh VpTPD chưa được hiểu rõ ràng và chưa có biện pháp điều trị hiệu quả. Dựa vào kết quả thu được cho đến nay có thể sử dụng Polyhexamethylene biguanide (PHMB) như một biện pháp phòng ngừa để kiểm soát nhiễm VpTPD sớm trong nuôi tôm. Sử dụng PHMB để khử trùng sẽ tiết kiệm chi phí. Theo thị trường chi phí khoảng 30-50 đô la Mỹ để áp dụng PHMB một lần cho mỗi lần 1.000m3 nước nuôi trồng thủy sản (1 mg/L). Tuy nhiên, việc xử lý nước nuôi trồng thủy sản từ môi trường rất phức tạp và chưa rõ liệu các chất khác ngoài mầm bệnh có hại cũng sẽ tiêu thụ PHMB.

Hình 7. Sản phẩm Polyhexamethylene biguanide (PHMB) thương mại

       Polyhexamethylene biguanide (PHMB) là một cation polyme và vật liệu nguyên bào sợi hòa tan trong nước có hoạt tính kháng khuẩn phổ rộng và hiệu quả. Cơ chế diệt khuẩn của PHMB khác với hầu hết chất khử trùng gốc clo được sử dụng rộng rãi. Clo giết chết vi khuẩn bằng cách oxy hóa protein, lipid và carbohydrate. PHMB phát huy tác dụng diệt khuẩn thông qua tương tác tĩnh điện với các vị trí âm tính trên thành phần lipopolysaccharide của màng tế bào vi khuẩn. Cụ thể, sự thu hút nhanh chóng của PHMB đối với các phospholipid tích điện âm trên bề mặt tế bào vi khuẩn gây ra sự phá vỡ cấu trúc màng tế bào và sự suy giảm hoạt động của màng, sau đó dẫn đến sự rò rỉ các chất nội bào, mất ion kali và kết tủa các thành phần nội bào, cuối cùng dẫn đến sự phân giải tế bào vi khuẩn. Do đặc tính kháng khuẩn tuyệt vời của nó, nó đã được sử dụng rộng rãi và được sử dụng an toàn như chất khử trùng và diệt nấm trong điều trị y tế, khử trùng thực phẩm công nghiệp và môi trường. 

       Qua thử nghiệm độc lực của PHMB đối với hậu ấu trùng tôm thẻ chân trắng, giá trị nồng độ gây chết trung bình của PHMB sau xử lý 24h, 48h, 72h, 96h là 16,13 mg/L (14,18-18,57), 10,77 mg/L (9,93-11,72), 9,68 mg/L (8,53-11,64), 9,14 mg/L (7,70-10,99), tương ứng. Nồng độ PHMB 1 mg/L cho thấy tác dụng bảo vệ mạnh mẽ đối với hậu ấu trùng tôm khi cảm nhiễm với 101-104 CFU/mL VpTPD. Tỷ lệ sống tương đối (RPS) trên hậu ấu trùng bị cảm nhiễm với VpTPD ở mức 101, 102, 103 và 104 CFU/mL lần lượt là 63,65%±6,81, 62,96%±5,56, 60,00%±3,75 và 66,67%±3,75 sau 96 giờ nhiễm bệnh. Do đó, PHMB có thể được sử dụng như một biện pháp phòng ngừa để kiểm soát nhiễm TPD sớm ở tôm. 

       Như vậy, nồng độ diệt khuẩn của PHMB đề xuất là 1 mg/L có thể thích hợp cho việc khử trùng hiệu quả các chất lắng, lọc và nước nuôi trồng thủy sản, trong khi nồng độ diệt khuẩn hiệu quả của PHMB có thể cần phải tăng vừa phải theo trường hợp có nhiều chất hữu cơ có trong nước nuôi trồng thủy sản. Ngoài ra, một số yếu tố trong thực hành nuôi trồng thủy sản có thể ảnh hưởng đến hiệu quả của chất khử trùng, chẳng hạn như độ pH, nhiệt độ, thời gian tiếp xúc và những yếu tố khác. Bên cạnh đó, quản lý chất lượng sức khỏe tôm bố mẹ, tôm giống không mang mầm bệnh và chất lượng nước là yếu tố cần thiết để phòng ngừa bệnh này. Việc sử dụng kháng sinh cần được hạn chế để đáp ứng nhu cầu sử dụng sản phẩm thủy sản không kháng sinh. Với những kết quả đạt được hiện nay về bệnh hậu ấu trùng mờ đục, thì thời gian tới sẽ phát triển được các kỹ thuật xác định chính xác và nhanh chóng tác nhân gây bệnh này, đồng thời xác định được cơ chế lây truyền để góp phần kiểm soát sự lây lan dịch bệnh trên tôm nuôi cũng như tôm tự nhiên trên toàn cầu. 

Hồng Mộng Huyền - Trường Đại học Kiên Giang

       Tài liệu tham khảo

       Zou, Y., Xie, G., Jia, T., Xu, T., Wang, C., Wan, X., ... & Zhang, Q. (2020). Determination of the infectious agent of translucent post-larva disease (TPD) in Penaeus vannamei. Pathogens, 9(9), 741.

       Liu, S., Wang, W., Jia, T., Xin, L., Xu, T. T., Wang, C., ... & Zhang, Q. (2023). Vibrio parahaemolyticus becomes lethal to post-larvae shrimp via acquiring novel virulence factors. Microbiology Spectrum, e00492-23.

       Jia, T., Xu, T., Xia, J., Liu, S., Li, W., Xu, R., ... & Zhang, Q. (2023). Clinical protective effects of polyhexamethylene biguanide hydrochloride (PHMB) against Vibrio parahaemolyticus causing translucent post-larvae disease (VpTPD) in Penaeus vannamei. Journal of Invertebrate Pathology, 201, 108002.

       Jia, T., Liu, S., Yu, X., Xu, T., Xia, J., Zhao, W., ... & Zhang, Q. (2024). Prevalence investigation of translucent post-larvae disease (TPD) in China. Aquaculture, 583, 740583.