Kể từ khi được mô tả chính thức vào năm 2009. Cho đến nay, EHP được xem là một mầm bệnh quan trong nhất đối với ngành nuôi tôm thẻ chân trắng ở Châu Á. Tuy nhiên, việc tôm thẻ chân trắng bị nhiễm bệnh EHP là do sự lây truyền từ các vật chủ khác sang tôm thẻ hay do sự thay đổi về phương pháp canh tác từ mô hình nuôi quảng canh lên mô hình nuôi thâm canh và siêu thâm canh. Bài viết sau đây sẽ tổng hợp thông tin về kết quả nghiên cứu đối với bệnh EHP trên tôm

       1. Lịch sử về bệnh vi bào tử trùng (EHP)

       Vi bào tử trùng (EHP) là một ký sinh gây bệnh trên gan tụy của tôm sú Penaeus monodon, tôm thẻ chân trắng Litopenaeus vannamei (Thitamadee et al., 2016), trên tôm thẻ xanh P. stylirostris (Tang et al., 2015) và tôm he Nhật Bản P. Japonicus (Chaijarasphong et al., 2021). Bệnh Enterocytozoon hepatopenaei  (EHP), là một ký sinh trùng được phát hiện trên gan tôm sú P. monodon và được khuyến cáo là nguyên nhân gây bệnh chậm lớn ở tôm sú vào năm 2004 tại thái lan (Chayaburakul et al., 2004). Tourtip et al., (2009) đã dựa vào phân tích cấu trúc mô học của loài, cho thấy EHP có cấu trúc siêu vi và đã đặt tên nó là vi bào tử trùng EHP. Cấu trúc siêu vi của loài ký sinh trùng này (Hình 1) cũng tương tự như một loài vi khuẩn HP microsporidium (HPM) đã được báo cáo gây bệnh trên tôm sú P. monodon ở Malaysia vào năm 1989 (Anderson et al., 1989) và trên tôm post của tôm he Nhật bản P. japonicus được khảo sát ở Úc vào năm 2001 (Hudson et al., 2001). Do đó, trong thời gian đầu họ cho rằng vi khuẩn gây bệnh giống EHP trên họ penaied của tôm là loài vi khuẩn đặc hữu của khu vực Châu Úc - Thái Bình Dương và lây cho các trang trại nuôi tôm vào những năm 1990 (Thitamadee et al., 2016). 

Hình 1. Mặt cắt ngan và cắt dọc của EHP (Tourtip et al., 2009)

       2. Ảnh hưởng của bệnh EHP đối với tôm 

       Mặc dù các báo cáo trước đây cho thấy EHP có tỷ lệ và cường độ nhiễm thấp trên tôm (Tourip et al., 2009), HPM do EHP đã gây ra dịch ở tôm penaeid cho ngành nuôi tôm ở Châu Á. Mặc dù EHP được xem là vi sinh vật gây bệnh phổ biến của tôm sú P. monodon từ năm 1990 đến năm 2000 (Flegel, 2012). Tuy nhiên, từ những năm 2002 đến nay tôm thẻ chân trắng ngày càng được nuôi phổ biến ở nhiều quốc gia, cùng với đó là sự gia tăng mật độ nuôi tôm thẻ chân trắng ngày càng cao đã tạo điều kiện thuận lợi cho sự xuất hiện của EHP và gây ảnh hưởng nghiêm trọng đối với nghề nuôi tôm (Thitamadee et al., 2016). EHP đã được chứng minh làm giảm tăng trưởng của tôm nuôi, các phân tích về định lượng EHP trên tôm thẻ chân trắng P. vannamei bằng phương pháp PCR cho thấy, tôm thẻ chân trắng có tốc độ tăng trưởng chậm khi số lượng EHP đạt 103 ng/tổng số HP-DNA (Liu et al., 2016; Rajendran et al., 2016). EHP làm tôm nuôi thường bị ốp thân dẫn đến phá vỡ mối tương quan giữa chiều dài và trọng lượng cơ thể tôm nuôi, làm giảm năng suất của tôm nuôi. Hơn nữa, nhiều báo cáo cho rằng tôm bị nhiễm EHP có liên quan đến hội chứng phân trắng (WFS) ở tôm thẻ chân trắng (Ha et al., 2010). Tuy nhiên, một số báo cáo sau đó chỉ ra rằng có thể EHP chỉ ảnh ảnh hưởng gián tiếp đến hội chứng gây bệnh phân trắng (WFS) hơn là ảnh hưởng trực tiếp (Tangprasittipap et al., 2013).

       Sanguanrut et al (2018) đã tiến hành nghiên cứu trên 196 ao nuôi tôm thẻ chân trắng P. vannamei ở Thái lan từ năm 2013 đến 2014, kết quả kiểm tra EHP bằng phương pháp PCR cho thấy hơn 60% số ao nuôi tôm nhiễm EHP và những ao này cũng có thể bị nhiễm bệnh EMS. Điều này cho thấy EHP là một mối đe dọa đối với ngành tôm trên toàn thế giới và được cảnh báo bởi các Trung tâm Nuôi trồng Thủy sản ở Châu Á Thái Bình Dương từ năm 2015. Bên cạnh đó, Sanguanrut et al (2018) cũng cho rằng, tôm giống giai đoạn post bị nhiễm EHP với mật độ thấp vẫn phát triển bình thường và không gây ra hiện tượng tôm bị chậm lớn, đặc biệt trong giai đoạn 30 ngày đầu. Tuy nhiên, tôm bị nhiễm bệnh sau 30 ngày sẽ có hiện tượng bị chậm lớn. Điều này cho thấy rằng, EHP cần có thời gian để gia tăng mật số trong cơ thể tôm và chỉ ảnh hưởng đến tôm nuôi khi đủ mật số đạt đến một số lượng cần thiết (Tourtip et al., 2009).

       3. Đặc điểm của tác nhân EHP

       - Phân loại và phân bố:
       EHP thuộc họ Enterocytozoonidae và ngành Microsporidia, họ này bao gồm các ký sinh trùng thuộc dạng đơn bào, có khả năng sinh bào tử. Họ này có khả năng ký sinh trên người, động vật, côn trùng và giáp xác (Vávra and Lukes, 2013). Hiện nay, có hơn một nửa số loài trong số những loài đã biết là có khả năng ký sinh và gây bệnh trên các loài động vật thủy sản (Stentiford et al., 2013b), trong đó có một số loài vừa có khả năng ký sinh trên giáp xác vừa có khả năng ký sinh trên cá như loài Agmasoma penaei, là một nguyên nhân gây bệnh đục cơ ở tôm (Laisutisan et al., 2009; Pasharawipas and Flegel, 1994). Ngành Microsporidia có mối quan hệ gần với ngành Crytomycota như Mycota hoặc nấm (James et al., 2013; Stentiford et al., 2019) và thuộc nhóm đơn ngành Holomycota (Liu et al., 2009; Sebé-Pedrós and Ruiz-Trillo, 2017; Torruella et al., 2015). Dựa vào đặc điểm mô tả của EHP, đã mở ra con đường về định loại các loài ký sinh trùng khác có trong ruột các loài động vật thủy sản như Enterospora, Nucleospora, Desmozoon, Obruspora và Hepatospora, đây là những ngành ký sinh trùng ảnh hưởng nhiều đến đường ruột của động vật không xương sống và động vật có xương sống, gây ra hội chứng ký sinh trùng đường ruột (EGM) (Stentiford et al., 2019). Ngoài ra, có các loài ký sinh trùng thuộc chi Parahepatospora có quan hệ gần với các chi kể trên cũng lây nhiễm cho động vật giáp xác nhưng không xuất hiện các dấu hiệu đặc trưng của hội chứng bệnh ký sinh trùng đường ruột (EGM) (Bojko et al., 2017). Do đó, việc xác định đúng mầm bệnh gây bệnh cho vật chủ ngày càng được quan tâm và xem xét cẩn thận về phương pháp xác định bệnh và định danh sinh vật gây bệnh (Stentiford et al., 2014), như EHP đã được xác định thông qua phương pháp PCR và dựa trên việc giải trình tự SSU. Vì vậy, đối với mỗi sinh vật gây bệnh cần áp dụng phương pháp và công cụ xác định bệnh thích hợp để xác định được phạm vi địa lý và sinh vật chủ. Do đó, EHP đã được xác nhận lần đầu tiên tại Thái lan (Tourtip và cộng sự, 2009), sau đó là Ấn Độ (Rajendran et al., 2016), Việt Nam (Hà et al., 2010; Tang et al., 2015), Brunei (Tang et al., 2015), Indonesia (Tang et al., 2016) và Trung Quốc (Liu et al., 2018). Tuy nhiên, Tang et al (2017) cho rằng EHP gây bệnh trên tôm thẻ chân trắng ở Venezuela là một loài khác, do nó có sự tương đồng thấp về trình tự gen của β-tubulin (93%) và thành bào tử protein (91%) so với EHP từ Thái Lan (Tourtip et al., 2009; Wiredu Boakye et al., 2017). Chính vì vậy, có thể các tác giả đã phát hiện ra một ký sinh trùng mới trong nhóm EGM và cần nghiên cứu thêm để phân lập và xác định loài cụ thể. 

       - Vòng đời :

       Vòng đời của các ký sinh trùng đơn bào có thể đơn giản hoặc phức tạp và có liên quan mật thiết đến một, hai hoặc nhiều loài vật chủ khác nhau (Cali et al., 2017; Vavrá và Lukes, 2013). Tương tự như các ký sinh trùng đơn bào khác, EHP có cả ngoại bào và nội bào và chúng sẽ giải phóng bào tử khi ở giai đoạn trưởng thành (Hình 2) (Han and Weiss, 2017; Vavrá and Lukes, 2013). Hầu hết các ký sinh trùng đơn bào khi lây bệnh cho vật chủ thường bắt đầu từ việc chúng hình thành bào tử và đâm thủng màng tế bào chủ và chuyển toàn bộ tế bào chất của chúng sang tế bào chất của vật chủ. Nguyên sinh chất của ký sinh trùng bắt đầu phân chia bên trong tế bào vật chủ, sau đó nguyên sinh chất của ký sinh trùng bên trong tế bào vật chủ bắt đầu tổ hợp lại để hình thành bào tử, trước sự phân cắt của tế bào chất các nguyên sinh chất hình thành các nguyên bào và sau đó hình thành các bào tử trưởng thành và nó vẫn nằm bên trong tế bào của vật chủ. Trong suốt quá trình nhân bào tử thì tế bào của vật chủ không ngừng bị tổn thương và cuối cùng nó vỡ ra và giải phóng các bào tử của ký sinh trùng, dẫn đến lây lan bào tử cho các tế bào khác hoặc giải phóng các bào tử trưởng thành vào môi trường nước thông qua phân thải và lây lan cho vật chủ khác (Tourtip et al., 2009). 

       Vòng đời của EHP cũng tương tự như các ký sinh trùng đơn bào khác. Tuy nhiên, chúng có chu kỳ sống phức tạp hơn so với các loài ký sinh trùng đơn bào khác (Vavrá and Lukes, 2013). Vòng đời của EHP trải qua nhiều giai đoạn và mỗi giai đoạn chúng tạo ra các loại bào tử khác nhau trên các vật chủ khác nhau. Trong một số trường hợp, bào tử có thể giống nhau về mặt hình thái khi quan sát bằng kính hiển vi quan học nhưng khác nhau về chức năng, cơ chế lây nhiễm cho cùng một vật chủ, trong khi loài khác chỉ lây nhiễm cho vật chủ trung gian (Stentiford et al., 2013a, 2013b). Như vậy trong chu kỳ sống có thể có sự chuyển tiếp giữa các giai đoạn sống chứa nhân đơn bội (sinh vật đơn bội) và nhân lưỡng bội (bao gồm hai nhân đơn đơn bội mà màng nhân của chúng vẫn áp chặt vào nhau) (Flegel  and Pasharawipas, 1995).

       Mặc dù các nghiên cứu cho thấy rằng EHP chỉ lây truyền cho các loài tôm thuộc họ penaeid theo phương ngang (Hình 2) (Tourtip et al., 2009). Chúng có thể lây truyền bệnh cho tôm thông qua các vật chủ trung gian như nhuyễn thể, mực và các loại thức ăn tươi sống khác dùng cho tôm ăn (Desrina et al., 2020; Karthikeyan and Sudhakaran, 2020; Kummari et al., 2018; Tang et al., 2015). Tuy nhiên, nếu chỉ dựa vào kết quả PCR trên các loại thức ăn tươi sống sử dụng cho tôm thì không đủ cơ sở để kết luận rằng chúng là vật chủ trung gian lây truyền bệnh cho tôm. Vì vậy, để kiểm soát EHP, cần phải xác định được vật chủ trung gian chính bị nhiễm bệnh và lây truyền sang tôm, đặc biệt ở các ao nuôi tôm. 

Hình 2. Vòng đời và con đường lây truyền của EHP (Tourtip et al., 2009).

       - Bào tử:

       Bào tử của EHP có cấu tạo dạng đơn bào, có hình bầu dục với kích thước 1,1 ± 0,2 µm × 0,6 ± 0,2 µm, với 5 - 6 cuộn dây phân cực có dạng hình ống (Hình 1) (Tourtip et al., 2009). Tương tự như các ký sinh trùng đơn bào khác, bào tử của EHP có cấu tạo gồm hai lớp, với lớp ngoài dày 10 nm và lớp trong dày 2 nm. Do đó, nó giúp bảo vệ được các bào tử chống chịu lại các điều kiện bất lợi của môi trường trong quá trình phát tán. Đây chính là một thách thức lớn cho các trang trại nuôi tôm khi tìm giải pháp làm bất hoạt hoặc tiêu diệt chúng trước khi chúng theo đường nước hoặc vật chủ trung gian xâm nhập vào ao nuôi (Thitamadee et al., 2016). Ngoài việc hình thành hai lớp bảo vệ thì vách bào tử EHP còn chứa protein vách (SWP), vách protein này đã được chứng minh có liên quan đến quá trình gắn bào tử EHP vào tế bào vật chủ (Chen et al., 2013; Jaroenlak et al., 2018; Li et al., 2009; Li et al., 2012; Peuvel-Fanget et al., 2006; Wang et al., 2015; Wu et al., 2009; Yang et al., 2016, 2014a, 2014b). EhSWP1 là một dạng protein của thành bào tử ký sinh trùng EHP được xác định bằng phương pháp phân tích trình tự toàn bộ bộ gen của EHP và được phân loại dựa vào nhóm SWP12 của protein vách bào tử ký sinh trùng đơn bào (Jaroenlak et al., 2016; Wiredu Boakye et al., 2017). Khi phân tích trình tự gen ở SWP2 cho thấy rằng, hầu hết các gen có dạng Bin - amphiphysin - Rvs - 2 (BAR2) và có ít nhất một gen chống đông máu (HBM), đoạn gen này giúp cho ký sinh trùng đơn bào dễ dàng gắn kết bào tử vào tế bào vật chủ (Kobayashi et al., 2010; Oliveira et al., 2012). EhSWP1 có khả năng chứa 3 đoạn gen HBM và một đoạn gen BAR2. Các thử nghiệm trên ống nghiệm cho thấy có sự gắn kết chặt chẽ giữa polysaccharide với vách protein EhSWP1 bình thường và dạng EhSWP1 đột biến (Jaroenlak et al., 2016). SWPs đã được tìm thấy phổ biến trên các chi Nosema và Encephalitozoon. Protein nội bào tử Encephalitozoon cuniculi, EcEnP1 (Peuvel-Fanget et al., 2006) và protein vách bào tử Nosema bombycis 16 (NbSWP16) (Wang et al., 2015) có liên quan mật thiết đến việc gắn kết bào tử với tế bào của vật chủ. Tuy nhiên, hiện nay các nhà khoa học vẫn chưa khẳng định được việc EhSWP1 có tham gia trực tiếp vào quá trình gắn kết giữa bào tử EHP với tế bào vật chủ, bỡi vì chưa có mô hình nghiên cứu sự lây nhiễm của EHP với tế bào gan tụy được nuôi cấy. Tuy nhiên, polysaccharide đã được phân lập thành công từ phần đầu của tôm thẻ chân trắng Litopenaeus vannamei và các gen trên chuỗi polysaccharide mạch dài (GAGs) tham gia vào cấu trúc gan tụy của tôm thẻ chân trắng (Chen et al., 2015), những phát hiện này đã góp phần giải thích sự kết dính của EhSWP1 với biểu mô gan tụy của tôm thẻ chân trắng Litopenaeus vannamei thông qua tương tác tỉnh điện giữa HBM và polysaccharide (Aldama - Cano et al., 2018).

       - Con đường lây truyền:

       Trong ao nuôi tôm, EHP lây truyền theo chiều ngang do tôm ăn phải bào tử EHP được thải qua phân của những con tôm bị nhiễm bệnh hoặc do chúng ăn những con tôm đang bị nhiễm bệnh (Hình 2) (Tangprasittipap et al., 2013; Tang et al., 2016). Salachan et al (2017) đã chứng minh được EHP có thể lây truyền qua đường nước, khi tiến hành thí nghiệm nuôi nhốt tôm bệnh và tôm khỏe được nuôi chung một bể nhưng được ngăn cách với nhau bằng lưới chắn. Sirikharin et al (2015) cũng báo cáo rằng, tôm bị nhiễm bệnh sau khi sử dụng mô gan tụy tôm bị bệnh trộn vào thức ăn và cho tôm ăn. Do đó, EHP được chứng minh chủ yếu lây bệnh qua đường miệng. Bỡi vì, đây là con đường mà mầm bệnh do vi khuẩn, EHP và độc tố dễ dàng tiếp xúc trực tiếp với khối gan tụy của tôm (Sirikharin et al., 2015; Tran et al., 2013). Bào tử EHP sau khi xâm nhập vào gan tụy của tôm chúng sẽ lây lan vào bên trong các tế bào biểu mô trên ống gan tụy của tôm (Tran et al., 2013). Karthikeyan và Sudhakaran (2019) cũng báo cáo rằng, ấu trùng tôm post thẻ chân trắng cũng dễ dàng bị nhiễm EHP khi bể nuôi được bổ sung các mô gan tụy bị nhiễm EHP. Như vậy, EHP có thể lây lan nhanh chóng giữa tôm bệnh cho tôm khỏe ở tất cả các giai đoạn của tôm, thông qua việc ăn bào tử từ phân tôm hoặc ăn tôm bị nhiễm bệnh. 

       Vu Khac et al (2018) đã báo cáo rằng ấu trùng Zoea1 và Zoea2 cũng bị nhiễm bệnh EHP khi tôm bố mẹ bị nhiễm EHP. Tuy nhiên, báo cáo này không mô tả rõ ràng về cơ chế lây truyền và giai đoạn Nauplius cũng không được báo cáo. Do đó, bệnh EHP trên ấu trùng Zoea có thể do ấu trùng ăn phải các bào tử EHP được thải qua phân từ tôm bố mẹ chứ không phải thông qua trứng hoặc tinh sào của tôm bố mẹ (Stentiford et al., 2013b). Mặc dù nghiên cứu trên tôm bố mẹ bị nhiễm EHP cho thấy, EHP chỉ xuất hiện trong gan tụy của tôm nhưng không có trong buồng trứng hoặc buồng tinh của tôm bố mẹ nên EHP rất khó lây truyền qua con đường sinh sản (Hình 3). Tuy nhiên, do nghiên cứu này sử dụng số mẫu nhỏ và chưa thực hiện trên tất cả các giai đoạn sống của tôm, do đó không thể đủ cơ sở để loại trừ khả năng EHP lây nhiễm theo chiều dọc. 

Hình 3. Kết quả xét nghiệm tôm bị nhiễm EHP bằng phương pháp nhộm gram H&E và ISH

       Mặc dù các kết quả nghiên cứu cho thấy, có thể EHP không lây nhiễm theo chiều ngang, nhưng tôm bố mẹ bị nhiễm EHP vẫn có thể lây nhiễm cho ấu trùng tôm theo chiều ngang sang con thông qua việc giải phóng phân có chứa bào tử EHP vào bể đẻ. Nauplius có thể bị nhiễm bệnh khi chúng bắt đầu ăn phiêu sinh vật ở giai đoạn Nauplius6. Do đó, việc rửa trứng hoặc giai đoạn đầu của Nauplius (Nauplius1 đến Nauplius5) bằng nước sạch trong trại sản xuất giống có thể giúp giảm lây nhiễm EHP. Điều này tương tự như việc quản lý bệnh do virus BMNV (baculovirus midgut gland necrosis virus)  (Momoyama, 1992) và baculovirus ở tôm thẻ chân trắng hoặc MBV (Penaeus monodon nudivirus hoặc PMNV) (Yang et al., 2014a, 2014b; Chen et al., 1992), những con virus gây bệnh gan tụy này cũng được truyền ngang sang ấu trùng tôm giai đoạn Nauplius6 hoặc các giai đoạn Zoea thông qua việc thải qua phân của tôm mẹ. Tuy nhiên, bệnh xuất hiện trong trại sản xuất giống cũng có thể do trại sản xuất giống không đảm bảo an toàn sinh học và không được vệ sinh tốt. Do đó, ấu trùng có thể nhiễm bệnh theo chiều ngang thông qua bào tử được thải qua phân của tôm bố mẹ hoặc chúng ăn thịt lẫn nhau hoặc thông qua quá trình lưu trữ bào tử gây bệnh từ vụ sản xuất trước mà trại ương chưa được vệ sinh tốt.  

       4. Dấu hiệu bệnh lý EHP trên tôm

       Các dấu hiệu lâm sàng được nhìn thấy từ bên ngoài có thể sử dụng để chuẩn đoán các trường hợp nghi nhiễm bệnh trên tôm. Tuy nhiên, tôm khi bị nhiễm bệnh EHP thì dấu hiệu nhìn thấy bên ngoài thường không có, ngoại trừ tôm chậm phát triển theo thời gian nuôi (Thitamadee et al., 2016). Hệ số tương quan giữa kích thước và trọng lượng thường được sử dụng để đánh giá mức độ nhiễm bệnh EHP trên tôm, với độ chính xác cao có thể thay thế phương pháp qPCR (Liu et al., 2018), đồng thời chỉ số này cũng giúp đánh giá hiệu quả kinh tế của vụ nuôi, đối với những ao nuôi có tỷ lệ tôm bệnh EHP khoảng 10% thì ao nuôi đến khi thu hoạch vẫn có lãi, nhưng tỷ lệ nhiễm bệnh của tôm trong ao từ 30% trở lên thì tôm thu hoạch sẽ không có lãi. Ngoài ra, các dấu hiệu mô học của EHP cũng được sử dụng để đánh giá mức độ nhiễm bệnh EHP trên tôm. Tuy nhiên, phương pháp này khó và dễ đọc kết quả sai, ngay cả đối với những nhà nghiên cứu về bệnh học (Lavanchy et al., 2016). Do đó, việc kết hợp giữa phương pháp quan sát mô học và kỹ thuật phân tích phân tử thường được tiến hành song song để khẳng định sự xuất hiện và mức độ nhiễm bệnh EHP trên tôm. 

       Các đặc điểm mô bệnh học đặc trưng của nhiễm bệnh EHP trên tôm bao gồm sự xuất hiện của các giai đoạn sống của EHP trong tế bào biểu mô ống gan tụy tôm và bào tử dạng tự do trong ống gan tụy khi tế bào biểu mô trên ống gan tụy bị tổn thương và bong tróc, những giai đoạn phát triển của EHP trong gan tụy của tôm được quan sát bằng phương pháp nhuôm hematoxylin và eosin (H &E) (Bell và Lightner, 1988; Tourtip et al., 2009; Tangprasittipap et al., 2013; Tang et al., 2015; Sanguanrut et al., 2018). Tuy nhiên, giai đoạn đầu của EHP khi xâm nhập vào tế bào vật chủ có bào tử rất nhỏ và phải quan sát chúng với kính hiển vi có độ phóng đại cao khoảng 1000 lần, nhưng chúng cũng khó phân biệt với tế bào vật chủ khi mẫu chưa được nhuôm màu, đặc biệt là trong trường hợp tôm bị nhiễm bệnh ở mức thấp. Do đó, để xác định tôm post hoặc tôm lớn bị nhiễm bệnh EHP ở mức độ thấp bằng phương pháp quan sát mẫu tươi thì toàn bộ khối gan tụy của tôm post hoặc một phần gan tụy của tôm lớn được phếch trên lame và nhỏ một giọt phloxine B 2% hoặc sử dụng Malechite để nhộm màu. Khối gan tụy của tôm nhỏ cũng có thể được quan sát trực tiếp trên kính hiển vi mà không qua nhuộm màu bằng cách đặt khối gan tụy trên lam kính, dùng kim tách nhẹ khối gan tụy và ép nhẹ bằng lame, các giai đoạn bào tử và các hợp bào của EHP sẽ được nhìn thấy rõ qua quan sát dưới kính hiển vi (Hình 4 a – d).

Hình 4. Các bào tử và hợp bào của EHP trong gan tụy của tôm

       Đối với tôm lớn thì khối gan tụy thường được cắt thành những lớp mô mõng và nhuộm bằng H&E. Phương pháp này giúp dễ dàng phân biệt được giữa bào tử và hợp bào của EHP (Hình 4e-f) với mô gan tụy của tôm (Hình 5a) (Bell và Lightner, 1988). Mẫu gan tụy tôm được cắt với hình thức mõng để quan sát dưới kính hiển vi quan học (Hình 5b) và siêu mõng để quan sát bào tử nấm (Enterocytozoon-group microsporidia - EGM) và EHP bằng kính hiển vi điện tử (Hình 6) (Tourtip et al., 2009), phương pháp quan sát mô học với hình thức cắt mô siêu mõng không chỉ giúp quan sát được bệnh EHP mà còn các bệnh khác gây bệnh trên gan tụy của tôm.

Hình 5. Ảnh bào tử và hợp bào của EHP được quan sát bằng kính hiển vi quang học sau khi phết gan tụy tôm trên lam và nhuộm H&E

       Phương pháp nhộm màu bằng H&E sẽ khó phân biệt được các giai đoạn phát triển của EHP. Do đó, một phương pháp nhuộm màu đặc biệt đã được phát triển để phát hiện ra các bào tử của ký sinh trùng (Moura et al., 1997; Weber et al., 1992), nó giúp nhận diện dễ dàng các bào tử EHP khi quan sát mẫu dưới vật kính 40. Tuy nhiên, phương pháp chromotrope có thể không đánh giá được mức độ nhiễm bệnh EHP khi quan sát dưới vật kính thấp, bởi vì rất khó để phân biệt được bào tử EHP trong tế bào gan tụy khi quan sát ở vật kính thấp (Hình 7). Trong khi đó, phương pháp ISH cho phép phát hiện EHP dựa vào phương pháp đánh dấu đối với gen SSU rRNA của EHP (Tangprasittipap et al., 2013; Tang et al., 2015). Chính vì vậy, phương pháp ISH được khuyến cáo trong xét nghiệm EHP để đánh giá mức độ nhiễm bệnh cũng như phát hiện các giai đoạn phát triển của EHP trong tế bào gan tụy, ngay cả khi mức độ nhiễm EHP rất thấp. Tuy nhiên, phương pháp ISH tương đối phức tạp nên không phù hợp cho việc ứng dụng nó vào thực tế xét nghiệm tại các trang trại nuôi tôm. Do đó, cần xem xét phương pháp xét nghiệm nhanh và đơn giản để giúp phát hiện sớm bệnh EHP trên tôm và giúp người nuôi kịp thời có giải pháp xử lý chúng. 

       5. Mối quan hệ giữa bệnh EHP và bệnh phân trắng

       Một số nghiên cứu đã cho rằng có thể có một mối quan hệ giữa tôm bị nhiễm bệnh EHP và tôm bị bệnh phân trắng. Bệnh phân trắng thường xuất hiện trên ruột tôm sau đó được tôm thải ra bên ngoài và nổi trên mặt nước ao nuôi tôm. Hiện tượng này thường được thấy trên các ao tôm đang bị nhiễm EHP. Tuy nhiên, khi làm trong phòng thí nghiệm thì không xảy ra hiện tượng tôm bị bệnh phân trắng sau khi bị nhiễm EHP (Ha et al., 2010; Tangprasittipap et al., 2013). Tangprasittipap et al (2013) đã báo cáo rằng, tôm trong ao nuôi có thể dương tính với EHP nhưng ao tôm không xuất hiện bệnh phân trắng. Ngược lại có những ao nuôi tôm không bị nhiễm EHP nhưng tôm vẫn bị bệnh phân trắng (Sriurairatana et al., 2014). Do đó, mối quan hệ giữa EHP và bệnh phân trắng có thể là gián tiếp. Bởi vì, tôm có thể bị bệnh phân trắng do các nguyên nhân khác như bị nhiễm ký sinh trùng, nhiễm vi khuẩn Vibrio sp…Vì vậy, việc quan sát sự xuất hiện của phân trắng trên mặt nước ao nuôi không thể sử dụng như là một chỉ tiêu để đánh giá khả năng nhiễm bệnh EHP của tôm nuôi. Do đó, cần phải quan sát mẫu phân trắng nổi trên mặt nước bằng kính hiển vi để phân biệt được nguyên nhân gây bệnh phân trắng do bào tử EHP hay do nhiễm ký sinh trùng, mẫu mô học cũng có thể được sử dụng để kiểm tra sự xuất hiện của Vibrio sp, khi quan sát kính hiển vi không xuất hiện EHP hoặc ký sinh trùng trong mẫu phân trắng. 

       Một giả thuyết khác cho rằng, khi tôm bị nhiễm EHP ở mức độ nặng thì vi khuẩn trong đường ruột tôm sẽ phát triển quá mức, đặc biệt là nhóm vi khuẩn kỵ khí. Có thể các vi khuẩn này là nguyên nhân gây ra bệnh phân trắng trên tôm (Hou et al., 2018). Tôm bị bệnh phân trắng thường chứa một lượng lớn các hợp bào phân nhánh để sản xuất bào tử và các tế bào ống gan tụy bị bong tróc và chứa đầy các bào tử EHP (Hình 8). Do đó, có thể giả thiết rằng các vi khuẩn đã kích hoạt quá trình sản xuất bào tử từ các hợp bào phân nhánh, dẫn đến sự bong tróc hàng loạt các tế bào mang theo bào tử EHP trong ống gan tụy và sự phát triển mạnh của các vi khuẩn được thể hiện rõ ở các sợi phân màu trắng trong ruột tôm (Hình 9) (Bass et al. 2019). 

       6. Phương pháp phát hiện và định lượng EHP

       - Lấy mẫu

       Việc lấy mẫu gan tụy đúng là rất quan trọng và nó quyết định cho độ chính xác của việc phát hiện và định lượng được EHP trong gan tụy tôm. Bởi vì, khi quan sát khối gan tụy tôm bằng phương pháp ISH thì EHP phân bố không đồng đều bên trong gan tụy của tôm (Flegel và Sritunyalucksana, 2018) (Hình 7, 10). Do đó, việc lấy một ít khối gan tụy tôm để xét nghiệm có thể mẫu đó chứa ít EHP hoặc nhiều hơn mật độ EHP phân bố trong toàn bộ gan tụy. Vì vậy, để đảm bảo độ chính xác (loại bỏ hiện tượng âm tính giả) và đánh giá mức độ nhiễm bệnh EHP trong gan tụy tôm thì toàn bộ khối gan tụy được thu và ly trích DNA để khuếch đại và phân tích bệnh EHP bằng phương pháp qPCR (Cruz-Flores et al., 2019).

       - Phương pháp xét nghiệm PCR

       Phương pháp PCR thường được áp dụng để chuẩn đoán nhiều loại bệnh trên tôm (OIE, 2019a, 2019b, 2019c). Phương pháp PCR một bước thường được sử dụng để chuẩn đoán bệnh EHP trên tôm (Tang et al., 2015; Tourtip et al., 2009), PCR hai bước (Jaroenlak et al., 2016; Tangprasittipap et al., 2013) và PCR đa mồi có thể giúp phát hiện cùng lúc bệnh EHP và các bệnh khác trên tôm (Koiwai et al., 2018). Tuy nhiên, phương pháp PCR một bước được thực hiện đơn giản hơn với một đoạn mồi nhưng khả năng phát hiện của chúng chỉ dao động trong khoảng từ 1.000 - 10.000 bản sao. Do đó, không đủ nhạy để phát hiện bệnh trong giai đoạn ủ bệnh. PCR hai bước sử dụng hai đoạn mồi để khuếch đại liên tục nên độ nhạy cao hơn khoảng 10 lần so với phương pháp PCR một bước. Do đó, nó cho phép phát hiện được bệnh với tỷ lệ nhiễm rất thấp. PCR hai bước có thể phát hiện bệnh EHP với 10 bản sao khuếch đại (Jaroenlak et al., 2016; Tangprasittipap et al., 2013). Mặc khác, PCR hai bước cho phép định lượng được mức độ nhiễm EHP (Jaroenlak et al., 2016).

       Mặc dù phương pháp PCR cho phép xác định được loài cụ thể nhưng kết quả đọc có thể sai nếu đoạn gen mồi được chọn có độ tương đồng nhiều với các loài sinh vật có mối quan hệ họ hàng gần nhau. Các gen SSU-rRNA đã được sử dụng rộng rãi làm đoạn mồi của PCR để xác định loài và chẩn đoán mầm bệnh. Bởi vì trình tự gen có sự khác nhau giữa các loài khác nhau nhưng tương đối giống nhau trong cùng một loài. Do đó, gen SSUrRNA được chọn làm đoạn gen mồi để giúp chuẩn đoán bệnh EHP trên tôm (Koiwai et al., 2018; Tang et al., 2015; Tangprasittipap et al., 2013; Tourtip et al., 2009). Tuy nhiên, trình tự gen SSU-rRNA có sự tương đồng cao với các vi bào tử trùng khác sống dưới nước (với độ tương đồng lên đến 68 - 90%) (Jaroenlak et al., 2016). Các đoạn mồi dựa trên gen SSU-rRNA của EHP có phản ứng chéo với các vi bào tử khác có mối quan hệ gần gũi như Enterospora Canceri (Stentiford et al., 2007) và Hepatospora eriocheir (Jaroenlak et al., 2016; Stentiford et al., 2011). Do đó, đoạn mồi SSU-rRNA có thể không phù hợp để kiểm tra phân tôm, thức ăn và nước trong ao. Bỡi vì, trong phân tôm, thức ăn thừa và nước ao có thể có các ký sinh trùng khác có mối quan hệ gần với EHP. Jaroenlak et al., (2016) đã thiết kế đoạn mồi nhắm vào gen protein vách bào tử (EhSWP1) và sử dụng phương pháp PCR hai bước để phân biệt chính xác EHP với các ký sinh trùng khác có mối quan hệ gần gũi, với độ nhạy cao (10 bản sao). Do đó, đoạn gen này sẽ được sử dụng để chuẩn đoán bệnh EHP trong mẫu phân, thức ăn thừa và nước ao nuôi. 

       - Phương pháp LAMP và RPA

       Hiện tại các nhà khoa học đang tập trung vào phát triển các phương pháp xét nghiệm nhanh để người nuôi có thể áp dụng dễ dàng để xét nghiệm bệnh tại các ao tôm như phương pháp LAMP (Mori và Notomi, 2009). LAMP có độ nhạy gấp 1000 lần so với phương pháp PCR một bước, giúp phát hiện bệnh với tốc độ nhanh hơn (Wong et al., 2017). Phương pháp LAMP đã được sử dụng để chuẩn đoán bệnh virus đốm trắng WSSV, virus đầu vàng (YHV), virus hoại tử cơ quan tạo máu và dưới da (IHHNV) và Vibrio parahaemolyticus (Arunrut et al., 2016; Kono et al., 2004; Mekata et al., 2006; Sun và cộng sự, 2006). Suebsing et al. (2013) đã sử dụng LAMP để chuẩn đoán bệnh EHP. Phương pháp này cho phép phát hiện EHP chỉ trong 0,02 fg tổng số DNA từ mô tôm bị nhiễm bệnh (tương đương với 1 bản sao EHP cho mỗi phản ứng) và nhạy hơn so với phương pháp PCR hai bước. Gần đây, SYBR Green I đã được sử dụng để nhuộm cho DNA, giúp phát hiện EHP với 10 bản sao DNA (Sathish Kumar et al., 2018). Tuy nhiên, SYBR Green có thể gây dương tính giả khi đoạn mồi dùng để khuếch đại LAMP không đặc hiệu (Zipper et al., 2004). Do đó, để giảm hiện tượng gây ra dương tính giả nên sử dụng đoạn gen EhSWP1 làm đoạn mồi để xác định EHP, thay vì sử dụng 4 đến 6 cặp đoạn mồi SSU-rRNA để chuẩn đoán EHP bằng phương pháp LAMP.

       Phương pháp RPA là một kỹ thuật khuếch đại DNA ở nhiệt độ cố định từ 37 đến 42oC trong thời gian 10 phút (Piepenburg et al., 2006; Euler et al., 2012; Krolov et al., 2014). Không như LAMP, RPA chỉ cần 1 cặp mồi để khuếch đại. Zhou et al (2020), đã sử dụng RPA để phát hiện gen SSU-rRNA từ EHP với độ nhạy ở mức 800 bản sao cho mỗi phản ứng (Zhou và cộng sự, 2020). Tuy nhiên, kết quả được đánh giá dựa vào gel điện di. Do đó, có thể không thuận tiện cho việc ứng dụng trực tiếp trên ao. Gần đây, Kanitchinda et al (2020), đã kết hợp giữa RPA với CRISPR-Cas12a để chuẩn đoán EHP (Kanitchinda et al., 2020). 

       - Phương pháp định lượng

       Mặc dù phương pháp định tính vẫn thường được áp dụng để chuẩn đoán bệnh, nhưng phương pháp định lượng vẫn cần thiết để xác định mức độ bệnh và tiến trình của bệnh. Phương pháp định lượng PCR (qPCR) được dùng để định lượng mầm bệnh dựa trên phương trình tương quan logarit giữa bản sao và số chu kỳ khuếch đại của PCR (Kralik và Ricchi, 2017). Phương pháp qPCR có thể phát hiện EHP lần lượt ở mức 83 và 40 bản sao EHP, khi lần lượt sử dụng SYBR-Green I và TaqMan để hiển thị các dải động kéo dài (Liu et al., 2016; Liu et al., 2018). Một số nghiên cứu đã cho thấy có mối tương quan nghịch giữa số lượng bản sao EHP với kích thước cơ thể tôm, khi số lượng khuếch đại trên 103/ng tổng DNA được chiết xuất từ gan tụy (Liu et al., 2016; Liu et al., 2018). Phương pháp LAMP cũng có thể phát hiện tôm bị nhiễm bệnh EHP với mức pha loảng 10-6 tổng số DNA của tôm bị nhiễm bệnh (Cai et al., 2018). Mặc dù có độ nhạy cao và có khả năng định lượng, nhưng máy dùng để phân tích qPCR rất đắt tiền và đòi hỏi nhân viên vận hành phải được đào tạo chuyên sâu về lĩnh vực sinh học phân tử (MendozaGallegos và cộng sự, 2018). Chính vì vậy, cần có sự nghiên cứu cải tiến phương pháp xét nghiệm để kỹ thuật này trở nên đơn giản hơn và rẽ hơn cho việc ứng dụng trong thực tế.

Ths. Nguyễn Thị Tiên - Trường Cao đẳng Cộng đồng Cà Mau

       Tài liệu tham khảo
       Aldama-Cano et al., 2018. Bioassay for spore polar tube extrusion of shrimp Enterocytozoon hepatopenaei (EHP). Aquaculture, 490: 156 – 161
       Cruz-Flores et al., 2019. Detection of Enterocytozoon hepatopenaei using an invasive but non-lethal sampling method in shrimp (Penaeus vannamei). J. Microbiol. Methods
Liu et al., 2018. Quantitative detection method of Enterocytozoon hepatopenaei using TaqMan probe real-time PCR. J. Invertebr. Pathol.